Mesenchymale Stammzellen zum Tissue Engineering von Knochen: Dreidimensionale osteogene Differenzierung auf mineralisiertem Kollagen

Abstract

Studienziel: Mesenchymale Stammzellen (MSC) eignen sich aufgrund ihrer Plastizität und ihrer hohen In-vitro-Proliferationskapazität zum Ersatz mesenchymaler Gewebe, z. B. Knochen. Zur Überbrückung dreidimensionaler Defekte ist eine Kultivierung auf Trägersubstanzen sinnvoll, um räumliche Strukturen vorzugeben. Bezüglich der Eignung zum Tissue Engineering von Knochen sind bereits verschiedene Zell/Matrix-Konstrukte untersucht worden. Das optimale Konstrukt wurde bisher jedoch noch nicht gefunden. Methode: In der vorliegenden Arbeit haben wir humane MSC nach Standardprotokoll aus Knochenmark isoliert und auf einer mineralisierten Kollagenmatrix kultiviert. Das entstandene Konstrukt wurde über 24 Tage unter dem Einfluss von Dexamethason, Ascorbinsäure und β-Glycerolphosphat osteogen induziert. Während des osteogenen Differenzierungsprozesses wurden Zellproliferation (Gesamtproteinbestimmung, WST-1-Vitalitätsassay) und osteogene Differenzierung (quantitative Real-Time-RT-PCR auf osteogene Marker) auf molekularer Ebene im Verlauf bestimmt. Die Verteilung der Zellen im Zell/Matrix-Konstrukt wurde histologisch untersucht. Ergebnisse: Lebende Zellen konnten während des gesamten Kultivierungszeitraumes sowohl histologisch als auch histochemisch in der Matrix nachgewiesen werden. Eine effektive osteogene Differenzierung wurde durch den Anstieg osteogener Marker (Osteocalcin und alkalische Phosphatase) während des gesamten Differenzierungsprozesses auf molekularer Ebene mittels Real-Time-RT-PCR gezeigt. Schlussfolgerung: Das vorliegende Zell/Matrix-Konstrukt ist somit ein Erfolg versprechender Kandidat für das Tissue Engineering von Knochen. Dies muss in entsprechenden In-vivo-Untersuchungen bestätigt werden. Aim: Due to their plasticity and high proliferation capacity in vitro, human mesenchymal stem cells (MSC) are promising candidates for substitution of mesenchymal tissues, such as bone. According to the tissue engineering concept, combinations of cells and three dimensional scaffolds are used to replace damaged tissue. Although various attempts have been made, the optimal combination of cells and artificial scaffold has not been found so far. Methods: In this work, human MSC were isolated from bone marrow aspirates according to standard protocols and cultivated on mineralized collagen. Osteogenic differentiation was induced by medium containing dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate. Cell proliferation on the scaffold (WST-1 vitality assay, total protein measurement) and osteogenic differentiation (quantitative Real-Time-RT-PCR) were monitored for 24 days. Results: Viable cells were found within the matrix throughout the cultivation period using histological and histochemical methods. Effective osteogenic differentiation could be demonstrated by the increase of expression of osteogenic marker genes (such as alkaline phosphatase) on a molecular level. Conclusion: Our results make the cell/matrix construct investigated in this work a promising candidate for tissue engineering of bone using mesenchymal stem cells. This has to be tested further by in vivo analysis.