Directed Evolution of the Fatty-Acid Hydroxylase P450 BM-3 into an Indole-Hydroxylating Catalyst

Abstract

The self-sufficient cytochrome P450 BM-3 enzyme from Bacillus megaterium catalyzes subterminal hydroxylation of saturated long-chain fatty acids and structurally related compounds. Since the primary structure of P450 BM-3 is homologous to that of mammalian P450 type II, it represents an excellent model for this family of enzymes. During studies on the directed evolution of P450 BM-3 into a medium-chain fatty-acid hydroxylase, several mutants, in particular the triple mutant Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly, were observed to hydroxylate indole, producing indigo and indirubin at a catalytic efficiency of 1365 M⁻¹ s⁻¹ (k_cat=2.73 s⁻¹ and K_m=2.0 mM). Both products were unequivocally characterized by NMR and MS analysis. Wild-type P450 BM-3 is incapable to hydroxylate indole. These results demonstrate that an enzyme can be engineered to catalyze the transformation of substrates with structures widely divergent from those of its native substrate. Cytochrom P450 BM-3, ein natürliches Fusionsprotein aus Bacillus megaterium, katalysiert die subterminale Hydroxylierung von gesättigten langkettigen Fettsäuren und strukturverwandten Verbindungen. Da seine Primärstruktur eine hohe Homologie zu P450-Monooxygenasen vom Typ II aus Säugetieren aufweist, ist das Bakterien-Enzym ein interessantes Modell für diese Enzymklasse. Während unserer Untersuchungen zur gerichteten Evolution von P450 BM-3 zu einer Hydroxylase, die mittelkettige Fettsäuren zu hydroxylieren vermag, beobachteten wir einige Mutanten, die auch Indol hydroxylieren und damit die Bildung von Indigo und Indirubin auslösen, wie wir durch NMR- und MS-Analyse der Produkte eindeutig nachweisen konnten. Die katalytische Wirksamkeit der Hydroxyindol-Bildung einer optimierten Dreifachmutante (Phe87Val, Leu188Gln, Ala74Gly) beträgt 1365 M⁻¹s⁻¹ (k_cat=2.73 s⁻¹ und K_m=2.0 mM). Das Ausgangsenzym P450 BM-3 ist zu dieser Reaktion nicht in der Lage. Unsere Ergebnisse zeigen, dass P450-Monooxygenasen durch gerichtete Evolution in einem Mass modifiziert werden können, dass sie auch Substrate umzusetzen vermögen, deren Struktur vom natürlichen Substrat sehr verschieden ist.