The double-antibody immunoassay of insulin

Abstract

Tracer¹³¹I-guinea-pig γ globulin provides a useful check of the efficiency of the insulin-antibody precipitation. It is employed (a) for the accurate preliminary standardization of the precipitating antibody; and (b) during assays to assess completeness of precipitation (in monitor tubes). Similar assays of human serum frequently yield spuriously high results; two responsible factors are (a) suboptimal second antibody precipitation arising from accentuation by serum of the “prozone phenomenon”, and (b) cross-reaction of rabbit anti-guinea-pig serum with human proteins. The former can be overcome by using ideal concentrations of reactants, prolonging incubation, and incorporating a standard amount of heparin, during the second reaction. The latter is minimized by using a rabbit anti-serum made to pure guinea-pig γ globulin. The double antibody method, thus modified, has proved consistently reliable. In the assay of human serum samples diluted 1/10 (i.e. 0.1 ml volumes of serum) optimal precipitation always occurs. Undiluted serum samples (i.e. 1.0 ml volumes) can also be assayed satisfactorily, when the occasional sub-optimal precipitation can be identified and a correction derived from the monitor tubes to yield a valid reading. Une globuline γ de cobaye marquée ๳¹I utilisée comme traceur fournit un contrôle utile de l'efficacité de la précipitation insuline-anticorps. Elle est employée a) pour la standardisation préliminaire précise de l'anticorps précipitant et b) au cours des dosages pour évaluer si la précipitation est complète (dans des tubes de contrôle). Des dosages semblables de sérum humain donnent fréquemment des résultats faux par excès. Deux facteurs en sont responsables: a) une précipitation sub-optimale par le second anticorps, qui résulte de l'accentuation par le sérum du “phénomène prozone”, et b) une réaction croisée du sérum de lapin anti-cobaye avec des protéines humaines. Le premier facteur d'erreur peut être supprimé en utilisant des concentrations idéales de réactants, en prolongeant l'incubation, et en incorporant une quantité standard d'héparine, au cours de la deuxième réaction. Le deuxième facteur d'erreur est réduit au minimum en utilisant un anti-sérum de lapin obtenu à partir de γ globuline pure de cobaye. La méthode au double anticorps, ainsi modifiée, s'est montrée constamment digne de confiance. Dans le dosage d'échantillons de sérum humain dilués au 1/10 (c'est à dire 0.1 ml de sérum) il se produit toujours une précipitation optimale. Des échantillons de sérum non dilués (c'est à dire 1.0 ml) peuvent également être dosés de façon satisfaisante lorsque la précipitation suboptimale occasionnelle peut être identifiée et qu'une correction peut être obtenue à partir des tubes de contrôle pour fournir une lecture valable. Spürdosen von¹³¹J-Meerschweinchenyglobulin bieten eine Möglichkeit zur Prüfung der Wirksamkeit der Insulin-Antikörperpräzipitation. Diese Methode wurde angewendet a) für die genaue vorläufige Standardisierung des präzipitierenden Antikörpers und b) zur Beurteilung der Vollständigkeit der Präzipitation während der Bestimmung (in den Kontroll-röhrchen). Ähnliche Untersuchungen des menschlichen Serums führen häufig zu fälschlich hohen Ergebnissen; dafür sind zwei Faktoren verantwortlich: a) eine nicht optimale sekundäre Antikörperpräzipitation, die durch eine Verstärkung des „Prozonphänomens” durch das Serum entsteht und b) die Kreuzreaktion des gegen Meerschweinchenserum gerichteten Kaninchenserums mit menschlichen Proteinen. Der erste kann durch Benutzung idealer Konzentrationen der reagierenden Substanzen, verlängerte Inkubationszeit und Zusatz einer Standardmenge von Heparin während der zweiten Reaktion ausgeschaltet werden. Der letztere wird durch Benutzung eines gegen reines Meerschweinchenyglobulin erzeugten Kaninchen-antiserums möglichst klein gehalten. Die so modifizierte Doppel-Antikörpermethode hat sich als vollständig zuverlässig erwiesen. Bei Untersuchungen des menschlichen Serums in einer Verdünnung von 1/10 (d.h. 0.1 ml Serummenge) kommt es immer zu einer optimalen Präzipitation. Auch unverdünnte Serumproben (d.h. 1.0 ml Serummenge) können zufriedenstellend untersucht werden, wenn die gelegentliche nicht optimale Präzipitation erkannt wird und, um eine gültige Ablesung zu bekommen, eine Korrektur von den Kontroll-röhrchen abgeleitet werden kann.