Control of yeast neutral trehalase by distinct polyphosphates and ribonucleic acid

Abstract

Die in einem rohen Extrakt aus Hefe bei pH 7 gemessene Aktivität von Trehalase nimmt bei der Inkubation mit 0,1% Polyethylenimin oder mit anderen Polykationen, wie Polylysin (0,075 mmol) oder Histon aus Kalbsthymus (0,08 mmol) auf das zwei- bis dreifache zu. Auch die Inkubation mit 3 mmol Mn²⁺ oder 5 mmol Ca²⁺ führt zu einer 3-, bzw. 1,6fachen Zunahme der Trehalase-Aktivität. Die Aktivität von 11 anderen Enzymen, die im rohen Extrakt aus Hefe bestimmt wurden, nimmt nach Zusatz von Polyethylenimin nicht zu. Bei der Inkubation mit Polyethylenimin, das eine maximale Stimulierung der Trehalase-Aktivität bewirkt, werden 97% der gesamten Ribonucleinsäure, 40% des gesamten Proteins und 60% des Polyphosphats (bestimmt als anorganisches Phosphat, das in 7 min bei 95 °C und pH O freigesetzt wird) präcipitiert. Eine gleichartige Präcipitation wurde bei der Inkubation mit Trehalase-stimulierenden Konzentrationen von Mn²⁺ beobachtet. Mit Polyethylenimin aktivierte Trehalase wird durch Ribonucleinsäure aus Hefe, anorganisches Polyphosphat und verwandte Polyanionen gehemmt. Vermutlich führt die Entfernung einer bestimmten Ribonucleinsäure-Fraktion und/oder von Polyphosphat zu der Polyethylenimin-induzierten Aktivierung der Trehalase. Wie von van Solingen und van der Plaat 1975 beschrieben [9], wird eine 4fache Stimulierung von Trehalase durch enzymatische Phosphorylierung mit ATP in der Gegenwart von cyclischem AMP und Mg²⁺ erreicht. Das so durch Phosphorylierung maximal aktivierte Enzym kann durch Zusatz von Polyethylenimin nicht weiter aktiviert werden. Das mit Polyethylenimin 2fach aktivierte Enzym kann jedoch noch einmal 2fach weiter aktiviert werden durch enzymatische Phosphorylierung. Aus diesen Beobachtungen wird geschlossen, daß die durch enzymatische Phosphorylierung bewirkte Aktivierung der Trehalase ein zweistufiger Vorgang ist: Zuerst findet die Entfernung eines Inhibitors statt (dies kann auch mit Polyethylenimin oder mit verwandten Kationen unabhängig von der enzymatischen Phosphorylierung erreicht werden), hierauf folgt weitere Aktivierung durch Konformationsänderung des Enzyms. Wahrscheinlich handelt es sich bei dem durch Phosphorylierung bzw. Behandlung mit Polyethylenimin abgetrennten Inhibitor um eine gewisse Ribonucleinsäure-Fraktion. The activity of yeast trehalase when assayed at pH 7 in a crude extract was found to increase 2- to 3-fold upon incubation with 0.1 % (v/v) polyethyleneimine or other polycations such as polylysine (0.075-mMol) and calf thymus histories (0.08 mMol). Incubation with 3 mM-Mn²⁺ and 5 mM-Ca²⁺ also led to 3- and 1.6-fold increases in trehalase activity, respectively. The activities of 11 other enzymes assayed in the crude yeast extract did not increase after addition of polyethylene imine. At concentrations of polyethylenemine that maximally stimulated trehalase activity, 97% of the total RNA present in the crude extract, 40% of total protein, and 60% of the polyphosphate (assayed as inorganic phosphate liberated during 7 min incubation at 95 °C and pH O) were found to be precipitated. A similar finding was made with trehalase-stimulating concentrations of Mn²⁺. Activation of trehalase by polyethylene imine rendered this enzyme susceptible to inhibition by a preparation of total yeast RNA, inorganic polyphosphates, and related polyanions. We present further evidence that the removal of a distinct RNA and/or polyphosphate is the basic principle of polyetyleneimine-induced activation of trehalase. A more pronounced stimulation of trehalase activity (4-fold) could be obtained by enzymatic phosphorylation with ATP in the presence of cyclic AMP and Mg²⁺ as described by van Solingen and van der Plaat (1975) [9]. Thus, trehalase 2-fold activated by polyethylene imine was further activated by another 2-fold increase by enzymatic phosphorylation. Conversely, no additional stimulation by polyethylene imine was obtained for the maximally active, phosphorylated enzyme. We conclude that phosphorylation-mediated activation of trehalase is a two-step event, one being the removal of an inhibitor, which can be achieved by polyethylene imine or related cations independent on phosphorylation. The most likely candidate for the inhibitor appears to be a distinct RNA.