MICROSATELLITE AMPLIFICATION FROM MUSEUM FEATHER SAMPLES: EFFECTS OF FRAGMENT SIZE AND TEMPLATE CONCENTRATION ON GENOTYPING ERRORS

Abstract

We address the problem of microsatellite genotyping errors associated with polymerase chain reaction (PCR) amplification from degraded and dilute template DNA and provide suggestions for improving the accuracy of genotype data in studies using older museum specimens as a source of DNA. In the course of a population genetics study of African indigobirds (Vidua spp.), we used replicate PCR to evaluate genotyping reliability for nine microsatellite loci in relation to PCR fragment length and DNA template concentration (DNA extracted from the calamus of one vs. two wing feathers). Complete amplification failure and the dropout of one allele from heterozygous genotypes were the predominant problems encountered. For samples with heterozygous genotypes, allele dropout occurred in 19.2 and 12.1% of PCR using extracts derived from one and two feathers, respectively. The amplification of artifact bands was less frequent (affecting 4.9 and 1% of positive PCR reactions with one- and two-feather extracts, respectively). Those results indicate that multiple replicates per sample and locus are required to obtain accurate genotype data from museum feather samples. Although higher DNA concentration improved success, PCR fragment size had a much stronger influence on the success and repeatability of microsatellite amplification, which suggests that the accuracy and efficiency of genotyping can be improved most easily by designing primers that amplify smaller DNA fragments. En este estudio abordamos el problema de los errores en el establecimiento de genotipos de microsatélites asociados con la amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ADN degradado y diluido como templete. También presentamos sugerencias para mejorar la exactitud de los datos genotípicos en estudios que utilizan especímenes de museo antiguos como fuente de ADN. En el transcurso de un estudio de genética de poblaciones de las especies africanas del género Vidua, utilizamos réplicas de PCR para determinar la confiabilidad en el establecimiento de genotipos para nueve loci microsatelitales con relación a la longitud del fragmento de PCR y la concentración del ADN templete (extraído del cálamo de una vs. dos plumas de las alas). Los problemas predominantes encontrados fueron el fracaso de amplificación y la pérdida de un alelo de genotipos heterocigotos. Para muestras con genotipos heterocigotos, la pérdida de alelos sucedió en 19.2 y 12.1% de las PCR usando extractos derivados de una y dos plumas, respectivamente. La amplificación de bandas artificiales fue menos frecuente, afectando el 4.9 y 1% de las reacciones de PCR con extractos de una y dos plumas, respectivamente. Estos resultados indican que para obtener datos exactos de genotipos a partir de plumas de museo es necesario utilizar múltiples réplicas por muestra y por locus. Aunque una mayor concentración de ADN mejoró el éxito, el tamaño del fragmento de PCR tuvo una influencia mucho más fuerte sobre el éxito y la repetibilidad de la amplificación de los microsatélites, lo que sugiere que la exactitud y eficiencia del establecimiento de genotipos pueden mejorarse más fácilmente diseñando iniciadores que amplifiquen fragmentos de ADN más pequeños.