Microscope fluorometric investigations on the reticulocytic maturation distribution as diagnostic criterion of disordered erythropoiesis

Abstract

A microscope fluorometric technique is described which permits not only the visual identification of reticulocytes under the fluorescence microscope but also the determination of their relative stage of maturation to normocytes. The technique is based on a specific staining procedure which results in a fluorescent complex between the reticulocytic RNA and acridine orange. Thus, the relative mass of RNA in the individual reticulocytes can be measured by means of microscope fluorometry. As the reticulocytic RNA content decreases and finally disappears during the final maturation process of reticulocytes after their release into the peripheral blood stream, the fluorescence signal indicates the relative degree of this maturation. A characteristic frequency distribution of this parameter can be obtained for a given blood sample by microscope fluorometry measuring 200 to 300 reticulocytes. The preliminary use of this technique for following up the course of two cases of hemolytic anemia and one of pernicious megaloblastic anemia during their treatment demonstrates the potential diagnostic value of this technique of identifying the change of the reticulocyte maturation distribution in addition to the reticulocyte count. Satisfactory agreement between the microscope fluorometric results and those obtained by counting separately the four reticulocytic maturation stages according toHeilmeyer andWesthäuser has been achieved. The possibility of obtaining quantitative and comparable results by use of this method may be considered a general advantage and a promising basis for the development of an automated technique. Es wird eine mikroskopfluorometrische Methode beschrieben, die über die visuelle Identifizierung von Retikulozyten unter dem Fluoreszenzmikroskop hinaus auch eine Bestimmung ihres relativen Reifungsgrades ermöglicht. Die Methode beruht auf einem speziellen Färbungsverfahren zur Erzielung eines fluoreszierenden Komplexes zwischen der Retikulozyten-RNS und Akridinorange. Die relative RNS-Menge in den einzelnen Retikulozyten kann somit mikroskop-fluorometrisch gemessen werden. Da der RNS-Gehalt der Retikulozyten im Zuge ihrer Reifung nach Entlassung in den peripheren Blutstrom abnimmt und schließlich völlig verschwindet, gibt das Fluoreszenzsignal das relative Stadium dieser Reifung an. Durch mikroskopfluorometrische Messung dieses Parameters an 200 bis 300 Retikulozyten läßt sich eine für eine gegebene Blutprobe charakteristische Häufigkeitsverteilung der verschiedenen Reifungsstadien ermitteln. Die erste orientierende Anwendung dieser Methode zur Verfolgung der Retikulozytendynamik in zwei Fällen von hämolytischer Anämie und in einem Fall von perniziöser megaloblastischer Anämie während der Retikulozytenkrise bestätigt den potentiellen diagnostischen Wert der Methode, die über die Bestimmung der Retikulozytenkonzentration hinaus Veränderungen der Retikulozyten-Reifungsgradvertéilung festzustellen gestattet. Die Ergebnisse der mikroskopfluorometrischen Reifungsgradbestimmung und der visuellen Einstufung der Retikulozyten in die Reifungsgradstadien I bis IV nachHeilmeyer undWesthäuser ergaben befriedigende Übereinstimmung. Es darf als ein genereller Vorteil dieser Methode gelten, daß sie nicht nur streng vergleichbare und reproduzierbare Meßergebnisse liefert, sondern auch als eine brauchbare Grundlage für die Entwicklung eines automatischen Bestimmungsverfahrens angesehen werden kann.